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詳情內(nèi)容 基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)又稱PCR實(shí)驗(yàn)，其特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加，PCR分子生物學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)的常規(guī)方法，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，例如：檢驗(yàn)艾滋病、乙型肝炎、禽疫病、癌基因的檢測(cè)和診斷，DNA指紋、個(gè)體識(shí)別、親子鑒別及法醫(yī)物證，動(dòng)、植物檢疫，動(dòng)物及其衍生產(chǎn)品檢測(cè)，動(dòng)物飼料、化妝品、食品衛(wèi)生檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因作物與轉(zhuǎn)基因微生物檢測(cè)等。
一、PCR實(shí)驗(yàn)室平面布局
基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室又稱PCR實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室原則上分為4個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域，前兩區(qū)為擴(kuò)增前區(qū)，后兩區(qū)為擴(kuò)增后區(qū)。擴(kuò)增前區(qū)與擴(kuò)增后區(qū)應(yīng)嚴(yán)格分開(kāi)。實(shí)驗(yàn)材料、試劑、記錄紙、筆、清潔材料等，只能從擴(kuò)增前區(qū)流向擴(kuò)增后區(qū)，即從試劑準(zhǔn)備區(qū)→樣品制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，不得逆向流動(dòng)。實(shí)驗(yàn)室的氣流也應(yīng)從擴(kuò)增前區(qū)流向擴(kuò)增后區(qū)，不得逆向流動(dòng)。各工作區(qū)域應(yīng)設(shè)置緩沖間，工作間與緩沖間之間宜安裝連鎖裝置。不同功能的核酸檢驗(yàn)工作區(qū)應(yīng)是分隔獨(dú)立的工作室，并有明顯的標(biāo)志：各區(qū)間不能直通。各區(qū)之間如果是緊密相連，需安裝物品傳遞窗。每個(gè)工作區(qū)域的頂部應(yīng)安裝紫外燈，紫外燈的波長(zhǎng)為254nm;安裝數(shù)量為每20㎡安裝一支40W的紫外燈。
實(shí)驗(yàn)室較為理想的布局模式為有一個(gè)專用走廓，試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)很規(guī)范地排列在一起，前三個(gè)區(qū)各有一個(gè)緩沖間，可供換工作服和工作鞋使用，頂上可裝一紫外燈。內(nèi)實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)為正壓或常壓狀態(tài)，緩沖間內(nèi)設(shè)為負(fù)壓狀態(tài)(可上設(shè)一抽風(fēng)裝置)，使這三個(gè)區(qū)的空氣流向?yàn)橛蓪?shí)驗(yàn)區(qū)域內(nèi)向外，緩沖間內(nèi)通向內(nèi)實(shí)驗(yàn)室和走廊的門(mén)可安裝一種連鎖裝置，當(dāng)一個(gè)門(mén)打開(kāi)時(shí)，另一門(mén)處于關(guān)閉狀態(tài)，防止出現(xiàn)兩個(gè)門(mén)同時(shí)打開(kāi)的情況。產(chǎn)物分析區(qū)可不設(shè)緩沖間，但應(yīng)設(shè)為負(fù)壓狀態(tài)(裝一個(gè)排風(fēng)扇即可)，使空氣流向由外向內(nèi)，以防止擴(kuò)增產(chǎn)物的隨空氣流出。每一區(qū)域都須有明確的標(biāo)記，工作按試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)至產(chǎn)物分析區(qū)單一 流向進(jìn)行，各區(qū)的儀器設(shè)備包括工作服、鞋、實(shí)驗(yàn)記錄本和筆等都專用。如果無(wú)法做到以上模式，以下基本要求做到：
(1)四個(gè)區(qū)域是相互獨(dú)立的。
(2)各區(qū)的儀器設(shè)備及各種物品是專用的。
(3)各區(qū)完全獨(dú)立，緩沖間可有可無(wú)。如為一個(gè)區(qū)套一個(gè)區(qū)的模式，區(qū)間不能直通，應(yīng)有緩沖間，供換工作服及鞋子用，并保 證兩個(gè)區(qū)域間始終處于完全的分隔狀態(tài)。
(4)產(chǎn)物分析區(qū)應(yīng)安裝排風(fēng)扇或其他抽風(fēng)裝置，維持負(fù)壓。
二、各區(qū)功能及主要設(shè)備
(1)試劑準(zhǔn)備區(qū)：擴(kuò)增試劑的配制、分裝和保存。未設(shè)緩沖間的試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)，工作區(qū)域?yàn)檎龎骸Ｓ糜跀U(kuò)增的試劑應(yīng)冰凍儲(chǔ)存。主要設(shè)備有天平、冰箱、離心機(jī)、加樣器、振蕩器、紫外燈。
(2)樣品制備區(qū)：實(shí)驗(yàn)室樣品的混樣和測(cè)試樣品的制備。未設(shè)緩沖間時(shí)工作區(qū)域?yàn)樨?fù)壓或減壓，可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。所用的器具在使用前應(yīng)經(jīng)過(guò)清洗并消毒，防止交叉污染。主要設(shè)備有冰箱、生物安 全柜(或潔凈工作臺(tái)、排風(fēng)柜)、離心機(jī)、加樣器、振蕩器、恒溫水浴、上下水設(shè)備、廢棄物容器、紫外燈。根據(jù)制備樣品的性質(zhì)和要求決定操作臺(tái)是選用生物安 全柜、潔凈工作臺(tái)還是排毒柜，如疾控中 心、臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室一般選用生物安 全柜，植物轉(zhuǎn)基因、檢疫等可選用排毒柜，樣品制備需要較高潔凈條件的選用潔凈工作臺(tái)。
(3)擴(kuò)增區(qū)：PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的配制和模板的加入，核酸擴(kuò)增。未設(shè)緩沖間的擴(kuò)增區(qū)，工作區(qū)域?yàn)樨?fù)壓或減壓，可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。加樣應(yīng)在超凈工作臺(tái)(生物安 全柜)內(nèi)進(jìn)行，超凈工作臺(tái)的氣流方向宜選擇垂流式。核酸擴(kuò)增設(shè)備、冰箱、潔凈工作臺(tái)(生物安 全柜)、離心機(jī)、加樣器、廢棄物容器、紫外燈。
(4)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)定。未設(shè)緩沖間的擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)，工作區(qū)域?yàn)樨?fù)壓或減壓，應(yīng)安裝排風(fēng)系統(tǒng)。若實(shí)驗(yàn)僅采用全自動(dòng)擴(kuò)增檢測(cè)儀(如實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀)，可將擴(kuò)增區(qū)與擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)合并為一個(gè)區(qū)。本區(qū)所使用的儀器設(shè)備有酶標(biāo)儀、洗板機(jī)、加樣器和水浴箱等。
三、實(shí)驗(yàn)室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)及壓力控制
各個(gè)區(qū)域之間應(yīng)具備單向的實(shí)驗(yàn)工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護(hù)屏障，避免實(shí)驗(yàn)之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程造成污染產(chǎn)生假性結(jié)果。
PCR實(shí)驗(yàn)室并沒(méi)有嚴(yán)格的凈化要求，但是為避免各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時(shí)，要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實(shí)驗(yàn)區(qū)的壓力要求。
四、實(shí)驗(yàn)室裝修
實(shí)驗(yàn)室的墻體，包括頂棚，應(yīng)結(jié)構(gòu)牢固、氣密性好;所有陰角宜采用圓弧形線條過(guò)渡;墻體內(nèi)壁光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒;地面材料應(yīng)滿足無(wú)縫隙、無(wú)滲漏、光潔、耐腐蝕的要求。地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好，便于進(jìn)行清掃，耐腐蝕。沒(méi)有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚(≥800mm)接縫需要小于2mm。燈具要選用凈化燈具，能達(dá)到便于清洗、不積塵的特點(diǎn)。
在三個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)和三個(gè)緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。在試劑準(zhǔn)備區(qū)和樣品制備區(qū)還設(shè)置移動(dòng)紫外線燈，對(duì)實(shí)驗(yàn)桌進(jìn)行局部消毒。
試劑和標(biāo)本通過(guò)機(jī)械連鎖不銹鋼傳遞窗傳遞，保證試劑和標(biāo)本在傳遞過(guò)程中不受污染。
試劑和樣品通過(guò)機(jī)械連鎖不銹鋼(不建議使用電子連鎖方式)傳遞窗傳遞，保證試劑和樣品在傳遞過(guò)程中不受污染(人物分流)。
五、注意問(wèn)題
(1)幾個(gè)區(qū)域的大小設(shè)置情況，應(yīng)該是試劑準(zhǔn)備區(qū)、產(chǎn)物擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增分析區(qū)，要小一些。樣品制備區(qū)應(yīng)大一些，因?yàn)闃悠分苽涫乙胖靡粋€(gè)生物安 全柜和一個(gè)低溫冰箱。
(2)試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品制備區(qū)設(shè)立緊急洗眼器，以備不時(shí)之需。
(3)PCR實(shí)驗(yàn)室的潔凈度可以根據(jù)用戶的實(shí)際使用情況和資金的投入來(lái)設(shè)計(jì)。
